Odborné aktivity

Jsme obklopeni křesťanskou kulturou s jejími morálními standardy, které zcela přirozeně považujeme za správné. Ale svět kolem nás je nekonečně pestrý. Možná i díky tomu je pro nás někdy obtížné posoudit z pohledu diagnostiky standardy jiných kultur bez odsudku, racionálně. Mnoho z nás si uvědomuje, že jsme součástí velmi bohaté západní Evropy s nejvyšší úrovní zdravotní péče na světě. A mnoho z nás možná žije s představou, že velká část světové populace této úrovně nedosahuje. Jaká je ale skutečnost?

Začínáme žít v době „informačního“ ráje. Máme stále více vědeckých dat, používané diagnostické metody jsou stále přesnější a přesnější, molekulární detekce jsou stále citlivější a citlivější …

Na první pohled je logické, že veškerý přínos pokročilých a stále se zlepšujících technologií molekulární biologie vidíme jako jednoznačné pozitivum a tím patrně zůstane i v budoucnu.

Nezapomínáme ale stále častěji na to, že molekulární biologie a genetika je pouze nástrojem, s pomocí kterého máme hledat odpovědi vedoucí ke správné diagnóze? Opravdu poskytují špičkové technologie dneška jednoduché odpovědi vedoucí k rychlé léčbě pacienta? Využíváme opravdu celý potenciál těchto metod dostatečně?

Jak jsou na tom ve skutečnosti naše klinické interpretační znalosti ve vztahu k velkému objemu a vysoké kvalitě získávaných dat?

Pokusme se ponořit společně do reálného světa, který občas přináší více otázek, než odpovědí a kde jedinou cestou hledání odpovědí asi vždy zůstane diskuse …

Při rozšíření jakékoliv metodiky v klinické laboratorní praxi zákonitě přichází snaha o její přesnou validaci a charakterizaci. Existují obory, kde metodiky a přístupy k validaci metod již dosáhly požadované standardnosti a výsledné soubory validovaných parametrů jsou stanoveny podle přesně daných metodik a postupů.

Typickým příkladem kvalitní validace v oboru přesahujícím do biologie a lékařské praxe je soubor standardizovaných biochemických diagnostických metod. V tomto oboru jsou již přesně terminologicky ukotveny a definovány jednotlivé parametry a postupy jejich validace (viz např. Metrologická terminologie v analytické laboratoři, SEKK 2003, International Vocabulary of basic and general terms in metrology, VIM, a další…).

Bohužel je nutno říci, že ze strany producentů CE IVD diagnostických souprav v molekulární biologii je až na výjimky kvalita a především jednotnost v postupech a terminologii určující základní parametry diagnostik více než nepřehledná.

Naše laboratoř se již několik let snaží zaměřit na standardizaci metod, které by byly schopny obecně definovat alespoň základní kvalitativní a kvantitativní parametry běžně používaných molekulárně biologických metod již ze strany jejich producentů.

Cílem prezentace je poukázat (teoreticky i experimentálně) na metodickou, definiční a interpretační nejednotnost výrobců CE IVD diagnostik v určování základních parametrů jako je stanovení meze detekce (LOD), lineárního rozsahu měření a meze stanovitelnosti (LOQ) a vyvolat diskusi odborné veřejnosti, která by v budoucnosti mohla přinést ujednocení metod validace již na straně producentů PCR souprav a tím klinické laboratoři významně usnadnit rozhodování při volbě diagnostika.

Žijeme v době, kdy molekulární mikrobiologie zaujímá své pevné místo ve schématu rychlé, přesné a spolehlivé diagnostiky závažných virových a bakteriálních onemocnění.

Tak jako v dobách masivního rozšíření klasické mikrobiologie jsme si velmi rychle osvojili poznatky a práci s molekulárně biologickými metodikami. A stejně jako tenkrát jsme výsledkům, které tyto metody dávají, začali téměř dogmaticky věřit.

Žijeme v době, kdy molekulárně mikrobiologické metody dávají rychlé, velmi přesné, ale občas zcela zavádějící výsledky!

Typickým příkladem z poslední doby mohou být falešně negativní výsledky detekce mutant Chlamydia trachomatis a Neisseria gonorrhoeae ve Švédsku a stále diskutovaná schopnost detekce rychle se vyvíjejících variant HIV (především pak jeho CRF forem). Diskutujme, jak zůstat při použití molekulárně mikrobiologických metod nadále spokojeni s jejich přesností a rychlostí, ale zároveň neztratit obezřetnost a zpětnou vazbu nad každým jednotlivým výsledkem, který nám tyto metody mohou dát.

V současnosti je již běžnou praxí použití panelů externí kontroly kvality, jako užitečného nástroje pro mezilaboratorní srovnání úrovně kvality práce jednotlivých klinických laboratoří.

Na poli molekulární mikrobiologie využívající DNA/RNA amplifikační techniky je dnes k dispozici několik standardizovaných EHK panelů od tuzemských i zahraničních dodavatelů. Mezi nejvýznamnější a v České republice nejvíce používané patří panely SZU, INSTAND a QCMD. Kvalita všech zmíněných panelů je na dobré úrovni stran kompozice a množství vzorků určených pro validace jednotlivých PCR technik. Výše uvedené panely se ovšem liší v části určené analýze dodávaných výsledků napříč celým spektrem zúčastněných laboratoří.

V laboratořích GeneProof se zaměřujeme především na hodnocení panelů QCMD ve vztahu k našim PCR kitům. Na základě podrobných analýz těchto panelů jsme zjistili, že nemusí sloužit pouze pro „prosté“ srovnání úspěšnosti laboratoře s ostatními, ale zároveň nám mohou dát přímý návod k nápravě vlastních laboratorních postupů ve chvíli, kdy výsledky našeho hodnocení nejsou ve srovnání s ostatními ideální.

Na základě našich poznatků s hodnocením QCMD panelů jsme vytvořili postup průběžné kontroly (a případně nápravy) kvality v celém diagnostickém procesu využívajícím PCR techniky.

V posledním desetiletí došlo v mikrobiologické a genetické diagnostice k masivnímu vývoji technologií využívajících metod molekulární biologie a genového inženýrství.

Po překlenutí poměrně dlouhého období vývoje těchto metod ze strany jejich primární optimalizace, charakterizace a převodu do stavu rutinního použití byly určeny nutné podmínky pro jejich použití v praxi. Pro stanovení těchto podmínek byly následně definovány (v molekulární mikrobiologii) základní parametry těchto metod obdobně jako v např. v biochemii. Do popředí se tak dostala například přesná charakterizace citlivosti a přesnosti měření. Pro stanovení těchto ukazatelů jsou dnes využívány již poměrně standardizované statistické modely, u kterých ovšem často chybí důkladná interpretace dosažených výsledků, což snižuje jejich praktickou využitelnost.

Typickým příkladem je využití statistického modelu Probit analýzy, který je dnes běžně používán pro určení citlivosti měření při použití Real Time PCR metod. Vzhledem k tomu, že se jedná o pravděpodobnostní model, je často obtížné prakticky určit reálnou citlivost metody v rutinním provozu. Navíc jakákoliv další práce s daty určujícími citlivost je opět zatížena zmíněným hodnocením v poli pravděpodobnosti.

Při vědomí výše uvedených problémů s interpretací dat jsme v naší laboratoři vytvořili na základě výsledků Probit analýzy teoretický model pro výpočet bezpečné detekce nízkých (definovaných) hladin patogenů za předpokladu směšování vzorků. Praktické využití tohoto modelu jsme následně experimentálně ověřili na definovaném počtu vzorků.

Práce byla prováděna za podpory dotačních programů:

• MPO ČR č. FI-IM5/042
• MPO FR-TI1/391

V posledních letech dochází k výraznému nárůstu použití technik molekulární biologie k detekci klinicky významných mikrobiálních a virových onemocnění. Molekulárně biologické detekce založené na kvantitativním PCR v reálném čase se, zvláště při stanovení některých patogenů, staly zlatým standardem v mikrobiologických laboratořích na celém světě.

Velký rozvoj těchto technik na jedné straně a nutnost standardizace a akreditace všech používaných vyšetření v rutinních laboratořích na straně druhé vede k nutnosti přesně validovat technické parametry zavedených PCR metod (sensitivita detekce, specificita detekce, přesnost kvantifikace patogena včetně validace variability kvantitativního stanovení a mnoho dalších parametrů…) a takto validované parametry ověřit pomocí nezávislých panelů externí kontroly kvality (Instand, QCMD, EHK…).

V naší laboratoři jsme vyvinuli a validovali soubor metodických postupů (a jejich konkrétních variant pro konkrétní patogeny) sledujících celý proces zpracování klinického materiálu od jeho odběru až po odečtení výsledků. Pro ověření našich postupů jsme použili (a používáme) panely kontroly kvality (Instand, QCMD) pomocí kterých jsme potvrdily správnost námi dosažených výsledků.

Práce byla prováděna za podpory dotačních programů:

• MPO ČR č. FT-TA3/098
• MPO ČR č. FI-IM5/042